Esta prova é, geralmente, usada para diferenciar os diferentes géneros das Enterobacteriaceae e para distinguir esta família de outros bacilos Gram negativo de origem intestinal. Esta diferenciação é feita atendendo às diferenças na fermentação dos hidratos de carbono presentes no meio e à produção de sulfureto de hidrogénio (H2S). Tanto o meio agar TSI (triple sugar iron) como o agar Kligler Iron contêm glicose em pequena concentração (0,1%), lactose em concentração superior (1%), o indicador de pH, vermelho de fenol, para detectar a produção de ácidos resultantes da fermentação dos hidratos de carbono, tiossulfato de sódio, substrato para a produção de H2S, e sulfato de ferro para a detecção desse produto final. A diferença entre estes dois meios diferenciais é que o TSI possui mais um açúcar, a sacarose, em concentração igual à da lactose (1%). Ambos os meios são inoculados por picada, no cilindro e por estria, na rampa. É essencial que as culturas sejam observadas após 18 a 24 h de incubação para evitar que os hidratos de carbono sejam completamente utilizados e que ocorra degradação das peptonas, formando produtos finais alcalinos. É na rampa que se faz a leitura da lactose e da sacarose, no fundo do cilindro a da glicose e no meio do cilindro a de H2S. Após incubação podem ser determinadas as actividades fermentativas, a produção de gás e a produção de H2S, podendo ocorrer vários resultados: Cilindro ácido (amarelo) e rampa alcalina (vermelha): Só a glicose foi fermentada. Os microrganismos degradam, preferencialmente, a glicose em primeiro lugar, mas como este substrato está presente em concentração mínima, a quantidade de ácido produzida é limitada e é rapidamente oxidada na superfície da rampa. Por outro lado, as peptonas do meio são também usadas na produção de substâncias alcalinas. No cilindro, a reacção ácida é mantida devido à tensão reduzida do oxigénio e ao crescimento mais lento dos microrganismos. O indicador, vermelho de fenol, muda para amarelo devido à persistência da formação de ácido no cilindro. Cilindro ácido (amarelo) e rampa ácida (amarela): Ocorreu a fermentação da lactose e/ou da sacarose, para além da glicose. Como as duas primeiras substâncias estão presentes em altas concentrações são substratos para a actividade fermentativa contínua com manutenção da reacção ácida (cor amarela) em todo o meio (rampa e cilindro). Produção de gás: Nota-se pela ocorrência de fracturas no meio de cultura. Produção de H2S: Ocorre enegrecimento, principalmente na zona intermédia do cilindro. Isto deve-se ao facto do microrganismo em estudo ser capaz de produzir sulfureto de hidrogénio (H2S), que se conjuga com um composto de ferro existente no meio, dando origem a sulfureto de ferro que, sendo insolúvel, precipita. Cilindro alcalino (vermelho) e rampa alcalina (vermelha) ou inalterado (tijolo): Não ocorreu fermentação dos hidratos de carbono presentes no meio, nem produção de gás ou de H2S. As peptonas do meio podem ser catabolizadas sob condições anaeróbias e/ou aeróbias, resultando num pH alcalino devido à produção de amónia. Se só ocorrer degradação aeróbia das peptonas, a reacção alcalina só é evidenciada na superfície da rampa. Se houver degradação aeróbia e anaeróbia das peptonas, a reacção alcalina é visível em todo o meio.
Prova de Kligler Iron Agar ou de Triple Sugar Iron Agar TSI
Esta prova é, geralmente, usada para diferenciar os diferentes géneros das Enterobacteriaceae e para distinguir esta família de outros bacilos Gram negativo de origem intestinal. Esta diferenciação é feita atendendo às diferenças na fermentação dos hidratos de carbono presentes no meio e à produção de sulfureto de hidrogénio (H2S). Tanto o meio agar TSI (triple sugar iron) como o agar Kligler Iron contêm glicose em pequena concentração (0,1%), lactose em concentração superior (1%), o indicador de pH, vermelho de fenol, para detectar a produção de ácidos resultantes da fermentação dos hidratos de carbono, tiossulfato de sódio, substrato para a produção de H2S, e sulfato de ferro para a detecção desse produto final. A diferença entre estes dois meios diferenciais é que o TSI possui mais um açúcar, a sacarose, em concentração igual à da lactose (1%). Ambos os meios são inoculados por picada, no cilindro e por estria, na rampa. É essencial que as culturas sejam observadas após 18 a 24 h de incubação para evitar que os hidratos de carbono sejam completamente utilizados e que ocorra degradação das peptonas, formando produtos finais alcalinos. É na rampa que se faz a leitura da lactose e da sacarose, no fundo do cilindro a da glicose e no meio do cilindro a de H2S. Após incubação podem ser determinadas as actividades fermentativas, a produção de gás e a produção de H2S, podendo ocorrer vários resultados: Cilindro ácido (amarelo) e rampa alcalina (vermelha): Só a glicose foi fermentada. Os microrganismos degradam, preferencialmente, a glicose em primeiro lugar, mas como este substrato está presente em concentração mínima, a quantidade de ácido produzida é limitada e é rapidamente oxidada na superfície da rampa. Por outro lado, as peptonas do meio são também usadas na produção de substâncias alcalinas. No cilindro, a reacção ácida é mantida devido à tensão reduzida do oxigénio e ao crescimento mais lento dos microrganismos. O indicador, vermelho de fenol, muda para amarelo devido à persistência da formação de ácido no cilindro. Cilindro ácido (amarelo) e rampa ácida (amarela): Ocorreu a fermentação da lactose e/ou da sacarose, para além da glicose. Como as duas primeiras substâncias estão presentes em altas concentrações são substratos para a actividade fermentativa contínua com manutenção da reacção ácida (cor amarela) em todo o meio (rampa e cilindro). Produção de gás: Nota-se pela ocorrência de fracturas no meio de cultura. Produção de H2S: Ocorre enegrecimento, principalmente na zona intermédia do cilindro. Isto deve-se ao facto do microrganismo em estudo ser capaz de produzir sulfureto de hidrogénio (H2S), que se conjuga com um composto de ferro existente no meio, dando origem a sulfureto de ferro que, sendo insolúvel, precipita. Cilindro alcalino (vermelho) e rampa alcalina (vermelha) ou inalterado (tijolo): Não ocorreu fermentação dos hidratos de carbono presentes no meio, nem produção de gás ou de H2S. As peptonas do meio podem ser catabolizadas sob condições anaeróbias e/ou aeróbias, resultando num pH alcalino devido à produção de amónia. Se só ocorrer degradação aeróbia das peptonas, a reacção alcalina só é evidenciada na superfície da rampa. Se houver degradação aeróbia e anaeróbia das peptonas, a reacção alcalina é visível em todo o meio.
A história dos Antibióticos
A coalhada de soja embolorada parece ter sido o primeiro antibiótico natural, utilizado pelos chineses por volta de 500 a.C. para tratar furúnculos e outras infecções semelhantes. Quase tão antigo, e presente em várias civilizações, é o uso de pão embolorado e teias de aranha em ferimentos infectados.
Embora os médicos tenham procurado nos 2 mil anos seguintes uma espécie de medicamento que combatesse a infecção por bactérias, nenhum pesquisador pensou em investigar cientificamente o folclore medicinal em relação aos bolores. O primeiro antibiótico moderno, a penicilina, foi uma descoberta casual do bacteriologista escocês Alexander Fleming, em 1928. Fleming havia sido um oficial médico nos hospitais militares da Inglaterra durante a Primeira Guerra Mundial. Notando a séria necessidade de um agente bactericida para tratar dos ferimentos infectados, após a guerra retornou ao St. Mary's Hospital, em Londres, para pesquisar sobre o problema. Em 1928, enquanto estudava o Staphylococcus aureus, uma bactéria responsável pelos abscessos e várias outras infecções, Fleming entrou de férias por alguns dias, deixando os seus recipientes de vidro com cultura sem supervisão. Ao retornar, notou que a tampa de um dos recipientes tinha escorregado e que a cultura tinha sido contaminada com o mofo da atmosfera.
Fleming estava quase a deitar fora a cultura quando a curiosidade o fez examiná-la. Na área onde o bolor estava a crescer, as células do Staphylococcus tinham morrido. Ele imediatamente percebeu o significado dessa descoberta e verificou que o bolor, uma espécie do fungo Penicillium, estava a segregar uma substância que destruía as bactérias. Embora ele não tenha conseguido isolar a substância - o que foi feito dez anos depois por Ernst B. Chain e Howard W. Florey, em Inglaterra -, ele chamou-a de penicilina. Muitos cientistas estavam cépticos quanto ao potencial do bolor que havia aparecido por acaso na lâmina de Fleming. Não se mostravam dispostos a experimentar nos seus pacientes um bolor comum. Outros problemas resultaram da fragilidade do bolor: ele era fraco, impuro e facilmente destrutível pelas mudanças climáticas e acídicas. Eram necessárias grandes quantidades para obter uma concentração de penicilina suficiente para um único paciente, e Fleming não tinha verbas suficientes.
Com a Segunda Guerra Mundial houve uma necessidade de anti-sépticos para combater as infecções das tropas feridas. O Dr. Howard Walter Florey, professor de patologia em Oxford, tinha ouvido falar sobre o bolor de Fleming e levou a pesquisa adiante. Com uma equipa de 20 cientistas e técnicos, Florey cultivou novamente o bolor de Fleming. Durante meses, a equipa manteve enormes tonéis de um caldo embolorado e malcheiroso, tentando extrair o ingrediente principal. O Dr. Ernst Boris Chain conseguiu extrair da solução um pó marrom, que destruiu instantaneamente algumas bactérias; na verdade, o extracto continha apenas cerca de 5% de penicilina na sua forma química pura. Os cientistas testaram a substância em 80 diferentes micróbios; descobriram que os fluidos do sangue não eram hostis à substância e que os glóbulos brancos não eram danificados nem se tornavam inactivos. Prepararam um sal de penicilina (contendo sais de sódio e cálcio), que era mais estável do que o bolor, e foram bem-sucedidos na cura de ratos que receberam injecções de doses fatais de Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, e outras bactérias. As suas descobertas formaram a base para o tratamento com penicilina que se pratica até aos nossos dias.
Em 1940, a penicilina foi utilizada, em Inglaterra, no primeiro paciente humano, um polícia com um quadro avançado de infecção sanguínea. Durante cinco dias os médicos administraram a droga a cada duas ou três horas (a penicilina sai rapidamente do corpo pela urina e, por isso, deve ser reposta em intervalos frequentes e regulares). O polícia tinha recuperado significativamente quando o suprimento de penicilina se esgotou e as injecções foram suspensas. A infecção alastrou-se e acabou por vencê-lo. Os cientistas britânicos ainda não tinham conseguido produzir penicilina em quantidade suficiente para salvar uma vida. Num segundo caso, no entanto, um jovem, que também sofria com uma infecção sanguínea, recebeu penicilina suficiente para se recuperar.
Embora os médicos tenham procurado nos 2 mil anos seguintes uma espécie de medicamento que combatesse a infecção por bactérias, nenhum pesquisador pensou em investigar cientificamente o folclore medicinal em relação aos bolores. O primeiro antibiótico moderno, a penicilina, foi uma descoberta casual do bacteriologista escocês Alexander Fleming, em 1928. Fleming havia sido um oficial médico nos hospitais militares da Inglaterra durante a Primeira Guerra Mundial. Notando a séria necessidade de um agente bactericida para tratar dos ferimentos infectados, após a guerra retornou ao St. Mary's Hospital, em Londres, para pesquisar sobre o problema. Em 1928, enquanto estudava o Staphylococcus aureus, uma bactéria responsável pelos abscessos e várias outras infecções, Fleming entrou de férias por alguns dias, deixando os seus recipientes de vidro com cultura sem supervisão. Ao retornar, notou que a tampa de um dos recipientes tinha escorregado e que a cultura tinha sido contaminada com o mofo da atmosfera.
Fleming estava quase a deitar fora a cultura quando a curiosidade o fez examiná-la. Na área onde o bolor estava a crescer, as células do Staphylococcus tinham morrido. Ele imediatamente percebeu o significado dessa descoberta e verificou que o bolor, uma espécie do fungo Penicillium, estava a segregar uma substância que destruía as bactérias. Embora ele não tenha conseguido isolar a substância - o que foi feito dez anos depois por Ernst B. Chain e Howard W. Florey, em Inglaterra -, ele chamou-a de penicilina. Muitos cientistas estavam cépticos quanto ao potencial do bolor que havia aparecido por acaso na lâmina de Fleming. Não se mostravam dispostos a experimentar nos seus pacientes um bolor comum. Outros problemas resultaram da fragilidade do bolor: ele era fraco, impuro e facilmente destrutível pelas mudanças climáticas e acídicas. Eram necessárias grandes quantidades para obter uma concentração de penicilina suficiente para um único paciente, e Fleming não tinha verbas suficientes.
Com a Segunda Guerra Mundial houve uma necessidade de anti-sépticos para combater as infecções das tropas feridas. O Dr. Howard Walter Florey, professor de patologia em Oxford, tinha ouvido falar sobre o bolor de Fleming e levou a pesquisa adiante. Com uma equipa de 20 cientistas e técnicos, Florey cultivou novamente o bolor de Fleming. Durante meses, a equipa manteve enormes tonéis de um caldo embolorado e malcheiroso, tentando extrair o ingrediente principal. O Dr. Ernst Boris Chain conseguiu extrair da solução um pó marrom, que destruiu instantaneamente algumas bactérias; na verdade, o extracto continha apenas cerca de 5% de penicilina na sua forma química pura. Os cientistas testaram a substância em 80 diferentes micróbios; descobriram que os fluidos do sangue não eram hostis à substância e que os glóbulos brancos não eram danificados nem se tornavam inactivos. Prepararam um sal de penicilina (contendo sais de sódio e cálcio), que era mais estável do que o bolor, e foram bem-sucedidos na cura de ratos que receberam injecções de doses fatais de Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, e outras bactérias. As suas descobertas formaram a base para o tratamento com penicilina que se pratica até aos nossos dias.
Em 1940, a penicilina foi utilizada, em Inglaterra, no primeiro paciente humano, um polícia com um quadro avançado de infecção sanguínea. Durante cinco dias os médicos administraram a droga a cada duas ou três horas (a penicilina sai rapidamente do corpo pela urina e, por isso, deve ser reposta em intervalos frequentes e regulares). O polícia tinha recuperado significativamente quando o suprimento de penicilina se esgotou e as injecções foram suspensas. A infecção alastrou-se e acabou por vencê-lo. Os cientistas britânicos ainda não tinham conseguido produzir penicilina em quantidade suficiente para salvar uma vida. Num segundo caso, no entanto, um jovem, que também sofria com uma infecção sanguínea, recebeu penicilina suficiente para se recuperar.
Microbiota Bacteriana Humana
Todo ser humano nasce sem microrganismos. A aquisição da microbiota bacteriana envolve uma transmissão horizontal, ou seja, infecciosa de microrganismos. A colonização de superfícies expostas como a pele, o trato respiratório, o sistema gênito-urinário e o trato digestório, começa imediatamente após o nascimento seja durante o parto normal, parto cesariana ou amamentação. Padrões de alimentação, hospitalização e tratamento com antibióticos são fatores que afetam a composição da microbiota intestinal em crianças.
As diversas partes do corpo humano apresentam condições ambientais diversas que oferecem certas vantagens e desvantagens para a vida microbiana. Diferentes espécies de microrganismos adaptam-se aos distintos ambientes do corpo.
A microbiota normal humana desenvolve-se por sucessões, desde o nascimento até as diversas fases da vida adulta, resultando em comunidades bacterianas estáveis.
Os fatores que controlam a composição da microbiota em uma dada região do corpo estão relacionados com a natureza do ambiente local, tais como temperatura, pH, água, oxigenação, nutrientes e fatores mais complexos como a ação de componentes do sistema imunológico.
Estima-se que o corpo humano que contém cerca de 10 trilhões de células seja rotineiramente portador de aproximadamente 100 trilhões de bactérias. A composição da microbiota bacteriana humana é relativamente estável com gêneros específicos ocupando as diversas regiões do corpo durante períodos particulares na vida de um indivíduo. A microbiota humana desempenha funções importantes na saúde e na doença.
Os microrganismos membros da microbiota humana podem existir como (1) mutualistas, quando protegem o hospedeiro competindo por micro-ambientes de forma mais eficiente que patógenos comuns (resistência à colonização), produzindo nutrientes importantes e contribuindo para o desenvolvimento do sistema imunológico; (2) comensais, quando mantêm associações aparentemente neutras sem benefícios ou malefícios detectáveis e (3) oportunistas, quando causam doenças em indivíduos imunocomprometidos devido à infecção pelo Vírus da Imunodeficiência Humana, terapia imunossupressora de transplantados, radioterapia, quimioterapia anticâncer, queimaduras extensas ou perfurações das mucosas.
A microbiota humana constitui um dos mecanismos de defesa contra a patogênese bacteriana, mas ainda que a maioria dos componentes da microbiota normal seja inofensiva a indivíduos sadios, esta pode constituir um reservatório de bactérias potencialmente patogênicas. Muitas bactérias da microbiota normal podem agir como oportunistas. Nestas condições a microbiota residente pode ser incapaz de suprimir patógenos transitórios, ou mesmo, alguns membros da microbiota podem invadir os tecidos do hospedeiro causando doenças muitas vezes graves. Em indivíduos sadios, algumas espécies de bactérias da microbiota oral causam cáries em 80% da população.
Fontes
Madigan MT, Martinko JM & Parker J. 1996. Biology of microorganisms, 8th. Prentice Hall, NJ, USA.
Trabulsi L.R et al. 1999. Microbiologia, 2a ed., Atheneu, SP.
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